Cómo secuenciar tu propio ADN en casa
(bradleywoolf.com)- Para quienes quieran intentar secuenciar su genoma con equipo personal, se organiza en un solo flujo el procedimiento real de un laboratorio casero, desde la recolección de células de la mejilla hasta el análisis de VCF, junto con el equipo necesario
- Las células del interior de la mejilla que se usan como muestra experimental son fáciles de obtener, pero no sirven para preguntas que requieren contexto tisular, como diagnóstico de cáncer o análisis de inflamación y expresión génica en tejidos específicos
- El valor de los datos genómicos no está tanto en recibir un diagnóstico inmediato, sino en convertir el VCF en una capa de referencia consultable para explorar variantes con VEP, ClinVar, gnomAD, PharmGKB, Gene Inspector, Claude y otros
- La preparación tomó alrededor de dos meses y solo el MinION cuesta unos 7,500 dólares, así que si se consideran equipo, reactivos, consumibles y entorno de análisis, sigue habiendo una barrera de costo alta para la persona promedio
- Una ejecución con baja entrada y baja cobertura no debe verse como una interpretación de grado médico, sino como una validación técnica, y es importante no sobreinterpretar las variantes de baja cobertura
Alcance y límites de la secuenciación de ADN en casa
- Se basa en la experiencia de haber secuenciado su propio genoma 5 veces con Oxford Nanopore Technologies MinION
- Se recolectan células del interior de la mejilla con un hisopo
- Se preparan como muestra para secuenciación
- Se cargan en el secuenciador
- Se analizan los datos resultantes
- Las células de la mejilla son fáciles de obtener y se reponen rápido, pero no son adecuadas para todas las preguntas biológicas
- No se usan para diagnóstico de cáncer
- No sirven para diagnosticar inflamación ni para verificar genes activados en otras partes del cuerpo
- Si se quieren ver genes expresados en células inflamatorias de una zona con urticaria en el pecho, hay que comparar las células problemáticas con células normales
- Toda la preparación tomó alrededor de dos meses y el costo sigue estando fuera del alcance de la persona promedio
- Los costos están bajando
- A largo plazo, se considera posible una tecnología que informe en tiempo real sobre ADN y expresión de ARN, como hoy ocurre con los teléfonos o la IA
Qué se puede hacer con los datos genómicos
- El genoma no es “magia”, sino una capa de referencia, y si se tiene un VCF se puede consultar con varias herramientas
- Entre las herramientas disponibles están VEP, ClinVar, gnomAD, PharmGKB, Gene Inspector, Claude y otras
- Con base en el VCF se pueden explorar preguntas como:
- Qué variantes se tienen
- Qué genes y rutas están afectados
- Qué fármacos podrían metabolizarse de forma distinta
- Qué variantes raras vale la pena revisar con seriedad
- En qué áreas el modelo todavía no sabe suficiente
- La información generada todavía no está a nivel de diagnóstico
- Tampoco implica conclusiones del tipo “como lo dijo una IA, edítate con CRISPR”
- El valor inmediato está en convertir un genoma estático en algo consultable
- El ADN es una referencia estable y el ARN se parece más al estado actual; a largo plazo, se considera posible integrar datos de biosensores en un solo modelo personal
Equipo y consumibles necesarios
- El hardware principal es Oxford Nanopore Technologies MinION y cuesta 7,500 dólares
- Laptop o workstation para ejecutar MinKNOW
- Almacenamiento de 100 GB o más para guardar la salida
- GPU para el basecalling con Dorado
- Vortex, heat block, centrífuga
- Entre los principales consumibles están el kit de secuenciación de ONT, el kit de limpieza de flow cell, material de control, PBS e hisopos bucales
- Los reactivos se dividen en extracción de ADN, preparación de biblioteca, priming del flow cell y medición de cuantificación
- NEB Monarch HMW DNA Extraction Kit for Cells & Blood: 87 dólares para 5 ejecuciones
- NEBNext Companion Module v2: 760 dólares para 24 reacciones
- Oxford Nanopore SQK-LSK114: 720 dólares para 6 reacciones
- nuclease-free water, Qubit fluorometer, Qubit dsDNA BR o HS Assay Kit
- También se necesita equipo de banco y consumibles plásticos por separado
- microcentrifuge, magnetic rack, tube racks, ice bucket, -20°C freezer, 4°C fridge, pipettes
- sterile cheek swabs, LoBind tubes, PCR tubes, Qubit assay tubes, filtered tips, wide-bore P200 tips, gloves
Flujo experimental: de la recolección a la biblioteca final
- El objetivo general es convertir 2 muestras de hisopo bucal en una biblioteca lista para secuenciar en MinION
- La etapa de preparación incluye uso de guantes, limpieza de la mesa, etiquetado de tubos, llevar las AMPure XP beads a temperatura ambiente, mantener las enzimas refrigeradas, ajustar el heat block a 56°C y verificar los reactivos de ONT
- La recolección y concentración celular sigue el flujo de raspar el interior de la mejilla durante 60 segundos, ponerlo en PBS y obtener un pequeño pellet blanco o grisáceo por centrifugación
- El PBS puede quedar un poco turbio
- Es importante no aspirar el pellet
- Con el kit Monarch se lisan las células y el ADN se une a las capture beads
- Después de la lisis, la prioridad es preservar el ADN de alto peso molecular, así que no se usa vortex
- No se deben perder las beads con ADN unido
- El gDNA Wash Buffer ya debe tener etanol agregado
- El ADN genómico purificado se cuantifica con Qubit
- Se usa 1x dsDNA High Sensitivity
- Si la concentración de la muestra es demasiado baja, se vuelve a medir en un tubo nuevo de Qubit usando más ADN
- Si solo se agrega ADN al tubo anterior, se rompe el cálculo del assay
- El mejor punto para pausar es justo después de la extracción de ADN
- Se etiqueta claramente el ADN en tubos LoBind
- Tras un quick spin, se guarda a 4°C sin usar vortex
Preparación de biblioteca y carga del flow cell
- La entrada ideal para repair/end-prep es 1,000 ng de ADN en 47 µL
- Si el ADN está demasiado diluido y no caben 1,000 ng en 47 µL, se usa el mayor volumen posible
- En el primer ejemplo de ejecución con baja entrada, 0.296 ng/µL × 47 µL dio unos 13.9 ng; estuvo muy por debajo de la entrada recomendada, pero sirvió para practicar el flujo completo
- Para repair/end-prep se usan FFPE DNA Repair Buffer v2, FFPE DNA Repair Mix y N-Prep Enzyme Mix
- Salt-T4 DNA Ligase no se usa en esta etapa sino después
- Si no se usa DCS, el 1 µL opcional de DCS se reemplaza con nuclease-free water
- Tras la limpieza con AMPure se agregan los adaptadores de secuenciación de ONT mediante adapter ligation
- La reacción incluye repaired/end-prepped DNA, LNB, Salt-T4 DNA Ligase y LA
- Si se omite LA, no se genera una biblioteca secuenciable
- Si se omite Salt-T4 DNA Ligase, falla la ligación de adaptadores
- Si no se mezcla bien LNB, empeora la química de ligación
- Se evita el vortex porque puede causar DNA shearing
- La limpieza de la biblioteca con adaptadores ligados usa LFB, no etanol
- La regla práctica es: “Liquid moves. Beads stay.”
- En la biblioteca final no se transfieren beads
- La biblioteca final también se vuelve a cuantificar con Qubit
- En ejecuciones de baja entrada, el valor puede salir bajo o incluso fallar
- En una ejecución de práctica, se puede evitar consumir repetidamente la biblioteca en Qubit y pasar con 12 µL de library al loading mix
Ejecución en MinION y procesamiento de datos
- En MinKNOW se revisa el flow cell y se registra el número de active pores
- Más de 1200: bueno
- 800–1200: usable
- 500–800: al límite o para práctica
- Menos de 500: malo, pero aún sirve para práctica mecánica
- Menos de 200: en la práctica tiene poco valor fuera de ensayar la carga
- En la etapa final se manejan tres tubos
- Final library: biblioteca de ADN después de la limpieza de adaptadores
- Priming mix: para preparar el flow cell
- Loading mix: incluye final library, sequencing buffer y library beads
- El flow cell tiene dos puertos
- Priming port: está bajo la cubierta deslizante y recibe el priming mix
- SpotON sample port: es un pequeño sample well donde se pone el loading mix gota por gota
- La Final library no se carga directamente en el flow cell; primero se pone en el tubo de loading mix
- La configuración básica de MinKNOW es la siguiente
- Flow cell type: FLO-MIN114
- Kit: SQK-LSK114
- Basecalling: ON
- Model: High-accuracy / HAC
- Barcoding: OFF
- Alignment: OFF
- Adaptive sampling: OFF
- Raw reads / POD5: ON
- Filtering: OFF en ejecuciones de práctica con baja entrada
- En ejecuciones de práctica con baja entrada, se recomienda dejar activado raw POD5 para poder analizar después aunque la salida en vivo no se vea bien
Pipeline de análisis
- Si hace falta, después de la ejecución se hace basecalling con Dorado
dorado basecaller sup pod5_directory/ > calls.bam- Si hace falta, conversión a FASTQ con
samtools fastq calls.bam > reads.fastq - Para una revisión rápida inicial se puede usar HAC en vez de SUP
- Para la referencia humana se usa GRCh38 FASTA
- Se crea el índice de referencia con minimap2
- Se alinean las reads con
map-ont - Con samtools se generan el índice BAM y flagstat, y con mosdepth se revisa la cobertura
- El llamado de variantes se hace con Clair3 y modelos de ONT
- La salida debe incluir un VCF
- No se deben sobreinterpretar variantes con baja cobertura
- La primera ejecución en MinION debe tratarse como validación técnica, no como interpretación de grado médico
- La anotación se hace instalando VEP y anotando el VCF con base en GRCh38
- Se agregan ClinVar, gnomAD y PharmGKB
- La tabla final incluye chromosome, position, ref, alt, gene, consequence, ClinVar significance, gnomAD frequency, genotype, read depth y variant quality
Material de referencia
- Seth Howes protocol: material de referencia sobre costos y protocolo para secuenciar un genoma en casa
- Quantifying Life: presentado como un material muy subestimado
- Integrated Drug Discovery Technologies: presentado como libro de referencia
1 comentarios
Comentarios de Hacker News
No querría secuenciarlo yo mismo en casa, pero sí me interesaría hacerlo con un servicio de terceros que entregue todos los datos en crudo
Soy un consumidor común que vive en Europa y me gustaría saber qué servicio recomiendan. Sería una gran ventaja si la empresa no conservara los datos, aunque no sé si se pueda exigir tanto
Véase el caso de la filtración de 23andMe: https://en.wikipedia.org/wiki/23andMe_data_leak
También hacen secuenciación del genoma completo de alta resolución si se les pide. Eso sí, tarda bastante, y dicen que se reservan el derecho de cancelar el pedido si uno se queja por los retrasos. No es la opción más barata, pero desde la perspectiva de privacidad para europeos me parece bastante buena. Cuanto más importante sea la privacidad, quizá hasta convenga una empresa un poco “difícil de tratar”
Dijo que él mismo lo había hecho así en varios países, aunque no sé si la gente lo ayudaba por su cargo. Aun así, estaba convencido de que incluso siendo solo un ingeniero de software uno podría encontrar a alguien dispuesto a ayudar. Si tienes un laboratorio cerca, vale la pena intentarlo
La razón principal de elegirlo fue que tenían una oferta barata de 30 euros en ese momento
Necesito lecturas largas porque la información que busco está en genes duplicados casi idénticos. Tengo archivos FASTQ y BAM de Dante Labs, pero no pude extraer de ahí la información que quería
No entiendo qué clase de brujería es eso de “como es un documento hecho para que lo lea la IA, copia la URL y pégala en ChatGPT para que te guíe. Si tienes gafas AR, mejor todavía, porque la IA puede hacerte seguir todo el protocolo”
También se puede leer directamente, pero el contenido es bastante denso
He pensado en una empresa que saque raíces de las tuberías de desagüe y, si hace falta, identifique mediante secuenciación de qué planta se trata, para decirte qué es lo que hay que matar antes de que la tubería colapse
Si eso puede posponer durante algunos años un reemplazo de tubería de 10 mil dólares, creo que mucha gente pagaría 100 dólares
https://www.envirodna.com/
https://www.naturemetrics.com/species-detection
https://www.ednacollab.org/industry/
https://wilderlab.co/
Estas empresas se enfocan en ADN ambiental. Algunas están más orientadas al monitoreo de gobiernos locales, y otras también atienden a clientes particulares
No me queda claro por qué haría falta esto. ¿Qué tanto mejor es un método para matar una planta específica que uno dirigido a todas las plantas que podrían estar ahí? Se podrían combinar varios tipos de tratamiento herbicida, y me da la impresión de que esa opción sería más barata que el costo del servicio
Es una idea realmente brillante y, si se dan las condiciones correctas, sin duda pagaría por ello
Aunque pensándolo bien, ¿no sería más barato lograr el mismo efecto echando algo como un herbicida biodegradable de amplio espectro por el drenaje?
Me pregunto cómo abordarían lograr que suficiente gente conozca el servicio y lo contrate. Aquí me hace pensar en una oportunidad de negocio mínima viable
Ya es difícil hacer que un plomero toque a tu puerta por menos de 100 dólares. Me pregunto si querías decir 500 dólares, o si esos 100 dólares se referían solo a la parte del análisis de laboratorio
Ojalá hubiera una discusión sobre los resultados. Los informes previos sobre este sensor y este proceso han sido bastante mixtos
El proceso en sí es genial, pero quisiera saber qué tan útiles son los resultados obtenidos en entornos reales
https://www.the-odin.com/whole-genome-sequencing-30x/
Si quieres hacerlo rápido y relativamente barato, hay una opción de 599 dólares
Por 7,500 dólares o más puedes obtener privacidad garantizada. Puede que otras características varíen, como dicen los comentarios, pero al menos los datos no salen de tu casa
Quiero hacer secuenciación, pero sin que ninguna empresa, gobierno o grupo religioso pueda acceder a mis datos.
Cuando el autor dijo que “si tienes un VCF, puedes pasarlo por herramientas como VEP, ClinVar, gnomAD, PharmGKB, Gene Inspector o Claude”, ¿no significa eso que mis datos terminarían en manos de justo las entidades que quiero evitar?
En cambio, con Claude sí le estarías entregando los datos. Pero ese paso no es indispensable. Si corres un pipeline estándar, obtienes un archivo VCF con las variantes genómicas, y puedes anotar cada variante. Al revisar los genes anotados, puedes determinar si una variante es patogénica, probablemente patogénica, probablemente benigna o benigna
Es realmente impresionante que se pueda hacer algo así con un objeto del tamaño de la palma de la mano. Si además llegan dispositivos CRISPR de tamaño similar, esto ya empieza a parecer la trama de Gattaca, así que quizá convenga detenerse ahí
He trabajado con extracción de ADN y secuenciación en laboratorio húmedo, pero fue hace casi 20 años, y aun así este trabajo es difícil y falla mucho. En particular, si no tienes un entorno extremadamente limpio, falla muchísimo más.
Incluso después de obtener los datos, hay que preguntarse qué tan precisos son considerando las condiciones de recolección, y también revisar errores de secuenciación correlacionados que quizá no se hayan tenido en cuenta. Además, la asesoría genética es un campo especializado que la gente estudia profesionalmente. Antes de preguntarle a un modelo grande de lenguaje qué significan tus datos genéticos para ti, deberías tener acceso a alguien que pueda poner esos datos en contexto y conectarte con especialistas relevantes. Aunque tuviera un doctorado en este campo, no confiaría en mi propia capacidad para interpretar mis datos de forma desapasionada y racional.
Aparte, no entiendo por qué el enlace de Molecular Biology of the Cell apunta a la 6.ª edición y no a la 7.ª, que salió hace 4 años. Los primeros tres volúmenes tenían como coautor al director de mi primer doctorado; él fue quien demostró que la idea de Roger Penrose de que los microtúbulos eran importantes en la quimiotaxis de E. coli era un completo disparate. Era una gran persona. En 2007 analicé datos de Illumina, que comercialmente aún estaban en una etapa muy temprana, y como podían alinearse al genoma de referencia, fue posible identificar ciertos sesgos. Es muy probable que la tecnología de nanoporos tenga aún más sesgos, y si no tienes la capacidad de tenerlos en cuenta, puedes meterte en problemas serios
Al menos así lo veo como alguien con maestría en bioquímica
En lugar de acudir a una empresa de genómica personal, también se puede contratar a una empresa que ofrezca servicios de secuenciación para laboratorios. En cuanto a los riesgos de interpretación, estoy completamente de acuerdo
Me gustó la parte enfocada en la privacidad. Dejando de lado el problema obvio de “pasarlo por Claude”, me da curiosidad cuántas de las herramientas de análisis mencionadas son completamente de código abierto o al menos se pueden ejecutar localmente.
Creo que habría sido bueno que el artículo abordara ese punto
¿Cómo sabría si el resultado que obtuve es real o si solo es basura?